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Nº 048
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[Título] [Introducción] [Resultados] [Discusión] [Iconografía] [Bibliografía]
Los ensayos in vitro se han realizado con líneas celulares renales de túbulo contorneado distal MDCK19 y de túbulo contorneado proximal LLC-PK120,21, obtenidas de American Type Culture Collection (Rockville, MO). Como control positivo de expresión de gp-P se utilizó una línea celular fibroblástica transfectada con el gen mdr1 humano que previamente ha sido caracterizada NIH-MDR-G18522, cedida por I.Pastan. MDCK y LLC-PK1 fueron mantenidas en medio de cultivo mínimo esencial (MEM) (Biowhittaker) suplementado con un 5% de suero bovino fetal inactivado (SBFI) (Biowhittaker), 56 ºC durante 30 min, a 37 ºC con un 5% de CO2. NIH-MDR-G185 fue mantenida en en medio de cultivo mínimo esencial modificado con sales de Dubelco (DMEM) (Biowhittaker) suplementado con un 10% de SBFI a 37 ºC con un 5% de CO2, para mantener la expresión de gp-P se adicionó al medio de cultivo 60 mg/mL de colchicina. Ambos medios estaban suplementados con 100 UI/mL de bencilpenicilina sódica (Roger) y 50 mg/mL de sulfato de estreptomicina (Cepa).
Colchicina (Sigma) y Verapamil (Sigma) fueron solubilizadas en agua bidestilada, Azatioprina (AZA) (Sigma) fue solubilizada en DMSO (Merck), Ciclosporina A (CsA) fue cedida por Sandoz AG, Tacrolimus® (FK506) fue cedida por Fujisawa España, ambos fueron solubilizados en etanol absoluto (Merck).
Los ensayos de citotoxicidad para las líneas renales se realizaron sembrando 5000 células/pocillo, durante la fase de crecimiento exponencial, en placas de 96 pocillos (Falcon). Después de 16 h a 37 ºC, se adicionó MEM con inmunosupresores (IS) en concentraciones decrecientes para cada línea y se incubaron durante 6 días a 37 ºC, cambiando el MEM con IS cada dos días. Terminado el período de incubación se estimó, mediante técnicas colorimétricas la densidad celular y su viabilidad empleando bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio (MTT) (Sigma) a una concentración de 5 mg de MTT/mL de tampón fosfato salino (PBS) (Sigma) de acuerdo con un método descrito previamente23, los ensayos se realizaron por triplicado.
Para la obtención de las curvas dosis-respuestas se calculó el porcentaje de supervivencia (%T/C) después de 6 días de incubación, que resultó de dividir la absorbacia media de las células tratadas (T) por la absorbancia media de las células control (C) y multiplicando por 100. El número de células fue calculado a partir de curvas patrón elaboradas para determinar los valores de absorbancia por el número de células. A partir de las curvas dosis-respuesta se determinó la concentración que inhibía el crecimiento celular al 50% (IC50) y la concentración que inhibía el crecimiento celular al 70% (IC70), para línea celular y para cada IS.
La inducción farmacológica se realizó en las líneas renales. Para ello se sembraron 1x106 células, en fase de crecimiento exponencial, en frascos de cultivo de 75 cm2 (Falcon). Depués de 16 h a 37 ºC, se adicionó MEM con IS a dosis subletales IC70 para cada línea, se incubaron durante 6 días y 14 días a 37 ºC, cambiando el MEM con IS cada dos días. Los ensayos se realizaron por triplicado.
Terminado el período de incubación las células fueron lavadas con solución tampón PBS y despegadas del frasco de cultivo con disolución tamponada de EDTA-tripsina (Sigma) (0.02%-0.125%: pH 7.2) durante 15 min. a 37 ºC. Una vez obtenida la suspensión celular se realizaron dos lavados con solución tampón PBS y se realiza el contaje celular en un citometro de flujo (CF) (Cytoron Absolute, Ortho) ajustandose la densidad celular a 5x105 células por mL.
1 - Los niveles de expresión de gp-P se determinaron mediante un método de inmunofluorescencia indirecta para citomentría de flujo previamente descrit24. Este método utiliza como anticuerpo primario monoclonal JSB-1 (Master Diagnóstica) y como anticuerpo secundario una IgG marcada con isotiocianato de fluoresceína (Biomeda). Por cada muestra se utilizó una densidad celular de 5x105 células. Los niveles de fluorescencia verde fueron analizados en un FC, determinando el número de células positivas (%POS), el canal medio de fluorescencia (CMF) de los histogramas obtenidos, y se calculó la incorporación media de fluorescencia específica (IMFE), que resultó de restarle al CMF del control positivo el CMF de su control negativo25. La determinación de los niveles de expresión de gp-P fue realizada a los cultivos celulares (MDCK , LLC-PK1, NIH-MDR-G185) en condiciones basales y a las líneas renales después del ensayo de inducción a 7 días y 15 días.
2 - El análisis del ciclo celular se realizó determinando la distibución celular en las distintas fases del ciclo (G0/G1, S, G2/M y FC=S+G2/M) con el CF, utilizando la disolución modificada de Vindelov26 cuyo fluorocromo, propidio de yodo (PI) (Sigma), al unirse principalmente al DNA celular estequiometricamente nos da el contenido de DNA de cada célula. Previamente a la incorparación de la disolución modificada de Vindelov, se realizó una incubación de las células con una solución permeabilizadora de octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100) (Sigma), al 0.05% (V/V) en disolución tampón PBS con un 0.1% (P/V) de albúmina sérica bovina (BSA) (Sigma) durante 15 min a temperatura ambiente, para permeabilizar correctamente la pared celular y nuclear. Por cada muestra se utilizó una densidad celular de 5x105 células. El análisis de ciclo celular fue realizado a los cultivos celulares (MDCK , LLC-PK1, NIH-MDR-G185) en condiciones basales y a las líneas renales después del ensayo de inducción a 7 días y 15 días.
3 - El ensayo funcional de la gp-P se realizó sobre una densidad celular de 5x105 células/500mL de PBS durante 60 min. a 37 ºC, como sustrato de la gp-P se usó un colorante fluorescente Rodamina12327 (Rh123) (Sigma), a una concentración final de 5 mM. Pasado el tiempo de incubación se analizaron los niveles de fluorescencia roja en el CF determinando el canal medio de fluorescencia (CMF) de los histogramas obtenidos. El ensayo funcional de la gp-P fue realizada en los cultivos celulares (MDCK, LLC-PK1, NIH-MDR-G185) en condiciones basales y en las líneas renales después del ensayo de inducción a 7 días y 15 días. El ensayo de bloqueo funcional de la gp-P se realizó sobre una densidad celular de la línea control NIH-MDR-G185 de 5x105 células/500mL de PBS durante 60 min. a 37 ºC usando Rh123 como sustrato y los IS a una concentración de 30 mM como posibles bloqueantes. Su efecto fue comparado con el de un conocido bloqueante Verapamil a una concentración de 30 mM. Pasado el tiempo de incubación se analizaron los niveles de fluorescencia roja en un CF determinando el CMF de los histogramas obtenidos.
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