Póster
Nº 004
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Muñiz, E.(1), Rodríguez-Mateo, L.(1), Martínez-Rodríguez, R. (2) y Gragera, R.R.(3)
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En la presente investigación se utilizaron 12 ratas Wistar adultas ( 250 g ), mantenidas en óptimas condiciones de luz y temperatura ( 21±1ºC ), libre acceso al agua y la comida y mantenidos en jaulas independientes. Los anumales de experimentación fueron anestesiados con Equitesin ( 60 mg kg-1 , Jansen Lab., USA ) y perfundidos transcardialmente con la solución fijadora de COMPLUCAD para tejidos y órganos ( 10%, v/v, en alcohol de 70% ), ajustando el pH de la solución cuidadosamente a 7.0-7.5.
Las muestras histológicas extraídas procedentes de diversos órganos, se postfijaron durante 4h a 4ºC en la misma solución fijadora de COMPLUCAD. Las muestras se deshidrataron posteriormente en un proceso muy corto de deshidratación con etanol en gradación creciente ( 3x15´ en etanol de 70%, 3x15´en etanol de 96%, 3x15´en etanol 100% y 10´en tolueno ). Posteriormente las muestras fueron incluidas en Parafina ( 56-58ºC de punto de fusión, MERCK ) y cortadas en un microtomo.
Los cortes de 5 ?m obtenidos se rehidrataron siguiendo el proceso inverso y se lavaron durante 15 minutos con PBS (tampón fosfato salino). Las secciones fueron procesadas según el método inmunohistoquímico del PAP (Sternberger, 1979) para la demostración inmunohistoquímica de diversas proteínas del citoesqueleto.
Las secciones histológicas fueron tratadas durante 30 minutos con H2O2 (0.3%, v/v) diluida en H2O destilada, con el fin de inhibir la peroxidasa endógena. Posteriormente los cortes fueron lavados repetidas veces con PBS y tratados con una solución 0.5M de L-lisina (Sigma Chem. Co.) en PBS a temperatura ambiente durante 2 h, lavando con PBS tras la incubación.
Las muestras histológicas se incubaron en continua agitación durante 2 h a temperatura ambiente con suero normal de cabra (Sigma Chem. Co.) diluido 1:1 en PBS. Los cortes fueron a continuación incubados durante 24 h a 4ºC en las diluciones de los siguientes antisueros monoclonales específicos desarrollados en ratón: anti-vimentina (diluida 1:40 en PBS) (Sigma Chem. Co.), anti-laminina (diluida 1:1.000 en PBS) (Sigma Chem. Co.), anti-citoqueratina (diluida 1:20 en PBS) (Sigma Chem. Co.) y anti-desmina (diluida 1:20 en PBS) (Sigma Chem. Co.). tras diversos lavados en PBS las secciones fueron incubadas durante 2 h a temperatura ambiente en el suero anti-ratón desarrollado en cabra (Sigma Chem. Co.) diluida 1:70 en PBS. Tras diversos lavados en la solución tampón, las secciones se incubaron en el complejo PAP de ratón, diluido en PBS ( 1:500 ) (Sigma Chem. Co.). Las secciones fueron porteriormente lavadas en PBS y el complejo PAP demostrado mediante el uso de 0.5 mg ml-1 de 3,3´-tetrahidrocloriçuro de diaminobenzidina (Sigma Chem. Co.) y 0.001% (v/v) de H2O2 disuelta en tampón Tris-HCl (pH=7.4) a temperatura ambiente.
Finalmente, las muestras fueron deshidratadas en una gradación creciente de etanol, y montadas con DePeX, para su posterior observación a nivel de la microscopía óptica.
Los controles negativos de la reacción inmunohistoquímica se llevaron a cabo de forma paralela e implicaron a) la utilización de suero normal de cabra en vez del antisuero específico y, b) la omisión del antisuero primario, sustituyéndolo por PBS.
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