Póster |
Muñiz, E.(1), Rodríguez-Mateo, L.(1), Martínez-Rodríguez, R. (2) y Gragera, R.R.(3)
(1) Departamento de Biología Celular. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Complutense de Madrid. 28040 Madrid. España. (2) Servicio de Anatomía Patológica. C.I.C. Carlos III. c/ Sinesio Delgado, 10. 28029 Madrid. España. (3) Departamento de Ciencias Morfológicas y Cirugía. Facultad de Medicina. Universidad de Alcalá de Alcalá de Henares. Madrid. España.
Departamento de Bilogía Celular. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Complutense de Madrid. 28040 Madrid. España.
El propósito del presente estudio es demostrar la utilidad de un nuevo fijador químico llamado COMPLUCAD (COMPLUCAD S.A. Lab., ESPAÑA; P9500471) en técnicas inmunohistoquímicas.
En el presente estudio se utilizaron 12 ratas Wistar adultas (250g) mantenidas en óptimas condiciones. Los animales fueron anestesiados con Equitesín (60 mg/kg) (JAnsen Lab., USA) y perfundidas transcardialmente con una solución al 10% (v/v) de COMPLUCAD en etanol (70%, v/v), ajustando cuidadosamente el pH de la solución. Las muestras histológicas se fijaron 82,4,6,8,12 y 24 horas) a 4ºC. Posteriormente se deshidrataron en una serie alcohólica creciente (comenzando con el alcohol de 70%). Se incluyeron en parafina y los cortes histológicos obtenidos se procesaron siguiendo el método inmunohistoquímico del PAP (Sterberger, 1979) para la demostración inmunohistoquímica de diversas proteínas del citoesqueleto. Los cortes se rehidrataron y lavaron con PBS durante 15 min. Posteriormente fueron tratados con 0.3% (v/v) de agua oxigenada diluída en agua destilada durante 30 minutos, con el fin de inhibir la peroxidasa endógena y lavados con PBS (30 min.). A continuación se trataron con 0.5M L-lisina (Sigma Chem. Co.) (2h a temperatura ambiente) y lavados con PBS (45 minutos). Posteriormente se incubaron en agitación durante 2h a temperatura ambiente en el suero normal de cabra (Sigma Chem. Co.) diluído en PBS (1:1). A continuación se incubaron los cortes en agitación a 4ºC en los siguientes antisueros monoclonales específicos desarrollados en ratón y diluídos en PBS: anti-citoqueratina (1:20), anti-vimentina (1:40), anti-laminina (1:1.000) y anti-desmina (1:20), todos ellos suministrados por Sigma Chem. Co. Tras diversos lavados en PBS, los cortes se incubaron a temperatura ambiente durante 2h en el suero normal de ratón (Sigma Cham. Co.) desarrollado en cabra diluído en PBS(1:70). Después de repetidos lavados en PBS se incubaron en el complejo PAP desarrollado en ratón (1:500 en PBS; Sigma Chem. Co.). Tras repetidos lavados en PBS, la peroxidasa se reveló utilizando 0.5 mg/ml de 3,3´-DAB (Sigma Chem. Co.) y 0.001% (v/v) de agua oxigenada disueltos en tampón Tris-HCl (pH=7.4, a temperatura ambiente). Posteriormente las muestras histológicas fueron deshidratadas, montadas en DePeX y observadas a microscopio óptico. Paralelamente se llevaron a cabo los controles negativos de la reacción inmunohistoquímica, que implicaron el uso del suero normal de cabra sustituyendo al específico y la omisión del antisuero primario.
Los resultados han demostrado que incluso con fijaciones cortas de 2 h, el COMPLUCAD proporciona una excelente fijación, preservando la antigenicidad de los tejidos. No se observó reacción alguna en ninguno de los controles negativos realizados.
El presente estudio es una primera aproximación a la utilización del COMPLUCAD en las técnicas inmunohistoquímicas.