Comunicación
Nº 022
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[Título] [Introducción] [Resultados] [Discusión] [Iconografía] [Bibliografía]
Las ratas, con un peso inicial entre 265 - 315 g, fueron divididas al azar en los siguientes grupos: 1) grupo CsA: 55 ratas tratadas con ciclosporina A (CsA) (Sandoz Pharmaceutical, Basilea, Suiza) (25 mg/kg/día); 2) grupo PLG: 35 ratas a las cuales se suministró propilenglicol (PLG) (Sigma Chemical Co., St. Luis, MO); 3) grupo CS: 14 ratas a las cuales se suministró una solución al 0.9% de cloruro de sodio (CS). El suministro de los fármacos fue para todas las ratas mediante bombas osmóticas Alzet 2ML4 (Alza Corp, Palo Alto, CA) implantadas subcutáneamente en la región dorsal de las ratas una vez anestesiadas intraperitonealmente con 40 mg/kg de pentobarbital sódico. Las bombas proporcionaron un suministro constante de 2.5 µl/h durante 28 días, después de los cuales fueron extraídas. Todos los animales recibieron una dieta de mantenimiento UAR A042 (Uar, Orge, Francia), con agua corriente ad libitum. Todos los animales se sacrificaron mediante punción cardíaca bajo anestesia con éter. La sangre fue extraída para realizar estudios funcionales a través de la evaluación de urea y creatinina en suero con un analizador Hitachi 705 (Boehringer Mannheim, Alemania) y medir el nivel de CsA en sangre mediante radioinmunoensayo (Cyclo-Trac SP, Incstar Corp, Stillwater, MN). Además, ambos riñones fueron extirpados y procesados para el análisis histológico. La experiencia tuvo una duración total de dos meses.
El estudio ha comprendido 104 muestras renales de ratas Sprague-Dawley macho (Charles River, Saint Aubin les Elbeuf, Francia), tratadas según la reglamentación del Gobierno Español y de la Unión Europea (Directiva EEC 86/609), y 55 biopsias hepáticas de sujetos normales y pacientes diagnosticados de hepatitis C, quienes dieron su consentimiento por escrito. Las muestras se fijaron en formalina tamponada al 4%, se incluyeron en parafina y se seccionaron de forma seriada a 4 µm de espesor. Los cortes de tejido, después de ser desparafinados, se mantuvieron 3-5 días en alcohol al 70% como mordentaje y se realizó la tinción con rojo Sirio-ácido pícrico F3BA (Gurr, BDH Chemicals Ltd., Poole, Reino Unido) al 1% para cuantificación con análisis de imagen24. El rojo Sirio tiñe las fibras conectivas de un color rojo intenso, mientras que tiñe las estructuras citoplasmáticas y los núcleos de las células de rojo débil y amarillo brillante25. Además, los cilindros hepáticos se tiñeron también con las tinciones de rutina (hematoxilina-eosina, reticulina, tricrómico de Gomori, Perls y PAS-diastasa) para la evaluación histopatológica convencional.
El sistema usado constó de una videocámara CCD en blanco y negro (Vidamax CCD BCD-700) acoplada a un microscopio Olympus Optical Co. Ltd. BH-2 (Tokio, Japón) con un adaptador Olympus MTV-3 y conectada a un PC compatible con un procesador Pentium-S 100 MHz (Intel Corporation, Santa Clara, CA), 16 Mbytes de memoria RAM, disco duro de 1 Gbyte, tarjeta gráfica S-VGA, tarjeta MVP-AT (Matrox Electronic Systems Ltd., Dorval, Canadá) con 1 Mbyte de memoria RAM para la captura y el procesamiento de la imagen, monitor RGB GVM-1411QM (Sony Corporation, Tokio, Japón) de alta resolución y monitor RGB MF-5117 (Iiyama Electric Corporation Co., Tokyo, Japón) de 17 pulgadas. El procesamiento y cuantificación de imagen se realizaron en ambiente MS-Windows 3.11 (Microsoft Corporation, Redmond, WA), a través de la aplicación original de análisis digital de imagen Fibrosis HR® (Master Diagnóstica S.A., Granada, España).
Las imágenes histológicas fueron digitalizadas con una resolución de intensidad luminosa de 8 bits (256 niveles de gris) y con un aumento global de 200X. El tamaño de la imagen óptica fue de 44221.34 µm² para una imagen de 256x256 pixeles cuadrados, lo que resultó en una resolución óptica de 0.67 µm² / pixel.
La aplicación Fibrosis HR® permitió depurar automáticamente las imágenes digitalizadas comparándolas pixel por pixel con una imagen de fondo previamente captada y normalizarlas expandiendo su histograma de niveles de gris a todo el rango de niveles disponibles26 (Figs. 1A, 1C y 2A). Las diferentes áreas de fibrosis en cada imagen digital se segmentaron y clasificaron de forma automática en relación a la región de pertenencia en la imagen (Figs. 1B, 1D, 2B y 2C).
En imágenes renales23, las regiones glomerulares se identificaron de manera semiautomática valiéndose de la "imagen negativa" de las áreas de fibrosis inicialmente aisladas. Interactivamente se conectaron con una línea poligonal las partes de la imagen en el interior de la cápsula de Bowman correspondientes al espacio urinífero y de forma automática se aislaron como región glomerular las partes conectadas y el área en ellas incluida (Fig. 1E). En caso de que la cápsula de Bowman presentara interrupciones en su perímetro y por tanto que la región glomerular no fuera identificada correctamente de manera automática, Fibrosis HR® permitió corregir interactivamente la región glomerular identificada. Las áreas previamente umbralizadas que se encontraban en la región glomerular fueron identificadas como áreas de matriz mesangial (Fig. 1F), mientras una segunda umbralización automática y un procesamiento de morfología matemática27,28 permitieron identificar el área flocular en la región glomerular sin incluir (Fig. 1G), o incluyendo (Fig. 1H), luces capilares y espacio urinífero intrafloculares.
En imágenes hepáticas29, el área porto-periportal y septal se extrajo procesando automáticamente, con transformaciones de morfología matemática 27,28, las zonas de condensación de fibrosis segmentadas previamente e identificando interactivamente entre estas el área porto-periportal y septal simplemente trazando sobre ella una línea poligonal (Fig. 2D). La misma polilínea fue utilizada para corregir los contornos de las áreas identificadas que, en tejidos patológicos, no coincidieran exactamente con los perímetros de las regiones porto-periportales. Las luces vasculares y los conductos biliares con área mayor de 160 µm² y localizadas dentro de la región portal fueron segmentadas automáticamente e interactivamente identificadas trazando encima de ellas una línea poligonal (Fig. 2E).
Todas las áreas extraídas fueron medidas automáticamente cuantificandolas en µm². En imágenes renales estas son: las áreas de fibrosis intersticial (AF), el área de matriz mesangial (AM), el área del flóculo glomerular (AFG), y el área glomerular (AG) (Fig. 1). En imágenes hepáticas: las áreas de fibrosis perisinusoidal y perivenular (FS), las áreas de fibrosis porto-periportal y septal (FP), el área porto-periportal y septal (AP), y las áreas de las luces vasculares y de los conductos biliares más representativos dentro de la región portal (AL) (Fig. 2). Además, se calcularon los porcentajes de estas áreas como sigue:
Todas las muestras renales y biopsias hepáticas fueron analizadas automáticamente con la aplicación Fibrosis HR®. De las muestras renales, dado que la distribución de la fibrosis en la corteza renal era irregular, se cuantificaron separadamente imágenes sólo con túbulos e intersticio (áreas peritubulares) e imágenes con glomérulos (áreas periglomerulares). Todas las imágenes fueron seleccionadas principalmente en las áreas de rayos medulares, donde usualmente aparecen los primeros signos de nefrotoxicidad inducida por CsA30. Para cada muestra histológica se analizaron 20 imágenes de áreas peritubulares y 20 de áreas periglomerulares y se consideraron como parámetros los valores medios por muestra de PAF en áreas peritubulares (MPAFT), en áreas periglomerulares (MPAFG) y sin distinción de área de pertenencia (MPAF), de AM (MAM) y de AG (MAG).
Las biopsias hepáticas, además de con la aplicación Fibrosis HR®, fueron evaluadas de forma histológica convencional aplicándose a cada una el índice de actividad de Knodell y su subíndice cuatro para la fibrosis (FK)8 y el sistema de gradación de la actividad inflamatoria y de la fibrosis de Scheuer (FS)9. En la cuantificación automática de la fibrosis hepática por histo-videomicroscopía, se evaluaron los seis espacios porta completos más alterados de cada biopsia, descartando los subcapsulares y considerando como parámetros los valores medios por espacio porta de FP (MFP), PFP (MPFP), AP (MAP) y APL=AP-AL (MAPL). Biopsias fragmentadas o con menos de cuatro espacios porta no fueron incluidas en la cuantificación. Además, a cada paciente se le realizó un perfil bioquímico hepático que incluyó el estudio de proteínas (totales y albúmina), enzimas (GOT, GPT, GGT, FA) coagulación (protrombina) y bilirrubina (coniugada y total).
Se comprobó la normalidad de las variables usando el test de Kolmogorov-Smirnov y, en caso contrario, la normalidad se aseguró a través de la transformación logarítmica de los datos.
Para el estudio estadístico del modelo experimental de riñón, de cada variable considerada se evaluaron las diferencias entre grupos de tratamiento mediante test de ANOVA de una vía con el tipo de tratamiento como factor y seguidos por test de Newman-Keuls. Además, se determinaron las correlaciones entre cada pareja de parámetros analíticos e histológicos cuantitativos usando test de correlación de Spearman.
En el estudio estadístico de las biopsias de hígado, para determinar la concordancia en la evaluación de la fibrosis entre el análisis convencional y la cuantificación mediante Fibrosis HR®, se determinaron las correlaciones de los valores de MFP, MPFP, MAP y MAPL con FK y FS, usando el test de correlación de Spearman. Además, el test de ANOVA de una vía, con FK o FS como factores y seguido por el test de Newman-Keuls, se realizó sobre los valores de MFP, MPFP, MAP y MAPL. También se analizó la correlación de las evaluaciones convencionales mediante FK y FS, e histológicas cuantitativas con las variables bioquímicas aplicando el test de correlación de Spearman. El mismo test se utilizó para evaluar la correlación de los índices de actividad de Knodell y Scheuer con las variables bioquímicas y con los parámetros histológicos cuantitativos y visuales de la fibrosis. Se aplicó también sobre las variables bioquímicas el test de ANOVA de una vía, con FK o FS como factores y seguido por el test de Newman-Keuls.
En todos los test las diferencias se consideraron significativas cuando p<0.05.
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