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Introduccion
Una serie de derivados de benzo[b] tiofenosulfonamida 1,1-dióxido (BTS) han sido descritos, recientemente, como una nueva clase de agentes antineoplásicos potenciales (1). Estos compuestos presentan actividad citotóxica frente a diversas lineas celulares tumorales (2,3), y algunos de ellos poseen valores de GI50 (concentración a la que se obtiene una inhibición del crecimiento celular del 50%) inferiores a 1 mM, lo que los hace especialmente prometedores como agentes quimioterápicos (3).
Es conocido que muchas drogas anticancer son capaces de inducir apoptosis sobre células tumorales (4-7). De la misma manera, se ha descrito que algunos compuestos BTS inducen un proceso de muerte celular con las características morfológicas y bioquímicas típicas de la apoptosis. Entre éstas se incluyen el arrugamiento celular, el transporte de fosfatidilserina hacia la capa externa de la membrana plasmática, la activación de caspasas y la degradación del DNA (8). Este proceso va acompañado por un acúmulo de radicales libres del oxígeno (ROS) (8). El acúmulo de ROS se ha propuesto como un suceso esencial en la respuesta apoptótica inducida por algunas drogas antitumorales (9,10).
En este trabajo estudiamos la relación existente entre el aumento de los niveles intracelulares de ROS y el proceso apoptótico inducido por los BTS.
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Material y Métodos
-Se estudiaron 6 compuestos de la familia de los BTS (figura 1), siendo los compuestos B-F derivados con distintos sustituyentes sobre el grupo sulfonamida del compuesto A
-Se determinó el % de apoptosis y los niveles intracelulares de ROS en células CCRF-CEM (leucemia linfoblástica aguda), tras 4 horas de incubación en presencia y ausencia de los distintos BTS. La apoptosis se determinó mediante la tinción conjunta con Anexina V-FITC e Ioduro de propidio (11).En el caso de ROS, se cuantificó la fluorescencia debida a carboxi-H2DCFDA (12). En ambos casos, las muestras se analizaron en un citómetro de flujo.
-Se estudió el efecto del antioxidante N-acetil-cisteína (NAC), tanto sobre el % de apoptosis como sobre los niveles de ROS. Las células fueron preincubadas con NAC (1mM) durante 1 hora antes de la adición de los BTS.
-Se cuantificaron los niveles de glutatión reducido (GSH) en estractos celulares de células control y células incubadas con los BTS. Se utilizó el sustrato fluorescente MCB (monochlorobimane) (2 mM) y las muestras se analizaron en un fluorímetro de placa. Los resultados se normalizaron respecto a la cantidad de proteína total.
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Figura 1 - fiogf49gjkf0d Figura 1.- Estructuras de los BTS empleados en este trabajo
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Resultados
-Todos los compuestos BTS provocaron un aumento en el % de células apoptóticas (figura 2a) y en los niveles intracelulares de ROS (figura 2b). Estos efectos fueron anulados, en su mayor parte por la N-acetil cisteína. Además, se observó una correlación directa entre el aumento en los niveles de ROS inducido por los BTS y su efecto apoptótico (figura 2c).
-Tras la incubación de las células con los 6 compuestos BTS, se observó una disminución progresiva de los niveles de GSH intracelular (figura 3)
fiogf49gjkf0dFigura 2.- Efecto de los BTS sobre la apoptosis y los niveles intracelulares de ROS. Las células fueron incubadas en ausencia (control) y presencia de BTS (A: 100 microM, B-F: 10 microM) y de BTS + NAC (1mM). (a): % apoptosis se refiere a % de células AnexinaV-FITC+ . (b): Se analizó la fluorescencia media debida a carboxi-H2DCFDA. Los resultados se expresan como media ± desviación típica de 3(en el caso de a) ó 6(en el caso de b) experimentos realizados por duplicado. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 con respecto al control; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 con respecto a su respectivo BTS. (c): Correlación entre apoptosis y niveles de ROS. Los puntos representan la media de los valores obtenidos para las distintas poblaciones celulares: control y A-F.">
Figura 2 - fiogf49gjkf0d Figura 2.- Efecto de los BTS sobre la apoptosis y los niveles intracelulares de ROS. Las células fueron incubadas en ausencia (control) y presencia de BTS (A: 100 microM, B-F: 10 microM) y de BTS + NAC (1mM). (a): % apoptosis se refiere a % de células AnexinaV-FITC+ . (b): Se analizó la fluorescencia media debida a carboxi-H2DCFDA. Los resultados se expresan como media ± desviación típica de 3(en el caso de a) ó 6(en el caso de b) experimentos realizados por duplicado. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 con respecto al control; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 con respecto a su respectivo BTS. (c): Correlación entre apoptosis y niveles de ROS. Los puntos representan la media de los valores obtenidos para las distintas poblaciones celulares: control y A-F.
Figura 3.- Descenso del GSH intracelular inducido por BTS. Muestras de células fueron incubadas en presencia o ausencia de BTS (A: 100 microM, B-F: 10 microM) durante diferentes periodos de tiempo. La concentración de GSH en extractos celulares se determinó mediante un ensayo fluorimétrico. Los resultados se expresan como porcentaje de GSH respecto a controles no tratados, y proceden de un experimento representativo de tres.
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Bibliografía
1 - Martínez-Merino V, Gil MJ, Encío I, Migliaccio M, Arteaga C. Benzo[b]thiophene sulfonamide-1,1-dioxido derivatives and their use as antineoplastic agents. WO Patent 00/63202. 2000.
2 - Gil MJ, Mañú MA, Arteaga C, Migliaccio M, Encío I, González A, Martínez-Merino V. Synthesis and citotoxic activity of N-(2-pyridylsulfenyl)urea derivatives. A new class of potential antineoplastic agents. Bioorg Med Chem Lett 1999; 9:2321-24.
3 - Villar R, Encío I, Migliaccio M, Gil MJ, Martínez-Merino V. Sinthesis and cytotoxic activity of lipophilic sulphonamide derivatives of the benzo[b]thiophene 1,1-dioxide. Bioorg Med Chem Lett 2004;12: 963-8.
4 - Cotter TG, Glynn JM, Echeverri F, Green DR. The induction of apoptosis by chemotherapeutic agents occurs in all phases of the cell cycle. Anticancer Res 1992; 12:773-9.
5 - Green DR, Bissonnette RP, Cotter TG. Apoptosis and cancer. Important Adv Oncol 1994; 37-52.
6 - Martin SJ, Green DR, Cotter TG. Dicing with death: dissecting the components of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci 1994; 19: 26-30.
7 - Oridate N, Lotan D, Mitchell MF, Hong WK, Lotan R. Inhibition of proliferation and induction of apoptosis in cervical carcinoma cells by retinoids: implications for chemoprevent. J Cell Biochem Suppl 1995; 23: 80-6.
8 - Alonso MM, Asumendi A, Villar J, Gil MJ, Martínez-Merino V, Encío I, Migliaccio M. New benzo(b)thiophenesulphonamide 1,1-dioxide derivatives induce a reactive oxigen species-mediated process of apoptosis in tumour cells. Oncogene 2003; 22:3759-69.
9 - Buttke TM, Sandstrom PA. Redox regulation of programmed cell death in lymphocytes. Free Radic Res 1995; 22: 389-97.
10 - Zamzami N, Marchetti P, Castedo M, Decaudin D, Macho A, Hirsch T, Susin SA, Petit PX, Mignotte B, Kroemer G. Sequential reduction of mitochondrial transmembrane potential and generation of reactive oxygen species in early programmed cell death. J Exp Med 1995; 182: 367-77.
11 - Figmonari C, Nüsse M, Cesari R, Iori R, Cantelli-Forti G, Hrelia P. Growth inhibition, cell-cycle arrest and apoptosis in human T-cell leukemia by the isothiocyanate sulforaphane. Carcinogenesis 2002 ; 23, nº 4 : 581-6.
12 - Gorman A, McGowan A, Cotter TG. Role of peroxide and superoxide anion during tumour cell apoptosis. FEBS Lett 1997; 404:27-33.
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